摘要：目的基于血浆代谢组学探究蒙药三臣小儿退热贴膏的解热作用及其机制。方法SD大鼠随机分为对照组、模型组、阿司匹林（mg/kg）组以及三臣小儿退热贴膏高、中、低剂量（16、8、4mg/kg）组和空白基质贴膏组，模型组和各给药组采用干酵母法建立发热模型，造模后第4、7小时各给药组给予相应药物进行干预，造模后每小时测量1次大鼠体温。采集造模后10h大鼠血浆，采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-QE-MS）法并结合多元统计分析，检测各组大鼠血浆代谢相关生物标志物的变化。结果造模4h后模型组大鼠体温显著升高（P＜0.01），造模后5h三臣小儿退热贴膏组大鼠体温显著降低（P＜0.01），呈剂量相关性。基于代谢组学发现模型组大鼠血浆中7种潜在的生物标志物发生明显变化，分别为酮亮氨酸、鞘磷脂[d17∶1/24∶1(15Z)]、鞘磷脂[d18∶1/24∶1(15Z)]、鞘磷脂[d18∶1/18∶1(9Z)]、磷脂酰胆碱（16∶0/14∶0）、磷脂酰胆碱（18∶0/15∶0）、磷脂酰胆碱（16∶0/16∶0）；三臣小儿退热贴膏组大鼠血浆中上述7种生物标志物含量均显著回调，且牛磺酸和异柠檬酸含量升高。代谢通路分析显示，三臣小儿退热贴膏能够影响牛磺酸和亚牛磺酸代谢、乙醛酸和二元酸代谢、柠檬酸循环、氨基酸代谢、初级胆汁酸生物合成、α-亚麻酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、鞘脂代谢等多种代谢通路。结论三臣小儿退热贴膏对干酵母致发热大鼠模型具有较好的解热作用，其药效与阿司匹林相当，其解热机制与酶抑制、脂肪代谢、氨基酸及能量代谢等多通路协同作用有关。
发热是指当机体体温中枢功能障碍或受到致热源侵袭时，体温升高超过正常范围的现象，是人体常见的一种症状。在体温调节中枢作用下，正常成年人机体的产热和散热处于动态平衡，而婴幼儿体温调节功能尚未完全发育成熟，在受到致热源侵袭时容易引起发热症状[1]。因此，发热是儿科最常见病症之一。在一定限度内的发热是机体抵抗疾病的生理性保护机制，可增强机体抗感染能力，若长期处于超高热状态，不仅使机体免疫功能下降，同时也对各组织、脏器造成损害，尤其易诱发婴幼儿惊厥等病症，甚至会产生器官衰竭等不可逆转的危害，威胁婴幼儿生命安全[2]。
蒙药三臣丸出自《四部医典》[3]，又名图喜木勒-3，由天竺*、红花和牛*3味中药组成，具有清热、解毒、止咳、镇惊的功效。三臣丸组方性凉，临床上主要用于治疗儿童肺热、肝热、惊悸等症[4-5]。由于具有良好的解热功效，三臣丸在蒙医临床中常作为小儿发热的首选药[6-8]。从现代研究的处方成分分析，三臣丸中的3味药材均具有解热、镇痛、抗炎的功效，可提高机体免疫功能，对多数的发热均具有解热、抗炎作用[9-10]。目前该制剂有散剂和水丸2种剂型[11]，但均不便于患儿服用，患者依从性较差，影响药物疗效。本研究将三臣丸改进为儿童易于接受的凝胶贴膏剂，采用干酵母致大鼠发热模型评价三臣小儿退热贴膏的解热作用；同时采用代谢组学技术，通过检测血浆代谢物探究三臣小儿退热贴膏对干酵母致大鼠发热模型的解热机制，以期为临床治疗小儿发热提供新的外用药物。
1材料
1.1动物
清洁级雄性SD大鼠，6周龄，体质量（±20）g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物许可证号SCXK（辽）-。大鼠分笼饲养，6只/笼，室温（25±2）℃、湿度（65±10）%，通风及光照条件良好，自由进食饮水。动物实验经内医院医学伦理委员会批准（批准号NM-LL--05-10-01）。
1.2药材
红花（产地为新疆，批号5）购自安徽中美堂中药饮片有限公司，天竺*（产地为云南，批号5）购自安徽省金芙蓉中药饮片有限公司，人工牛*（批号202）购自四川费德力制药有限公司，经内蒙古民族大学蒙医药学院蒙药教研室布和巴特尔教授鉴定，红花为菊科植物红花CarhamustinctoriusL.的干燥花，天竺*为禾本科植物青皮竹BambusatextilisMcClure杆内的分泌液干燥后的块状物，人工牛*为由牛胆粉、胆酸、去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工制成。
1.3药品与试剂
活性干酵母粉（批号20106W）购自安琪酵母股份有限公司；氯化钠注射液（批号）购自山东华鲁制药有限公司；硫化钠（批号）购自山东西亚化学工业有限公司；阿司匹林肠溶片（mg/片，批号BJ）购自德国Bayer公司；甘油（批号20715）购自辽宁泉瑞试剂有限公司；聚丙烯酸钠（批号20P46NF）购自上海冠英生物科技有限公司；酒石酸（批号）购自天津天力化学试剂有限公司；氮酮（批号）购自临沂市绿森化工有限公司；LC-MS级乙腈、甲醇购自德国CNWTechnologiesGmbH公司；LC-MS级乙酸铵购自美国Sigma公司；LC-MS级氨水购自美国FisherChemical公司；超纯水购自屈臣氏。
1.4仪器
Vanquish超高效液相色谱仪、QExactiveHFX高分辨质谱仪、HeraeusFresco17型离心机（美国ThermoFisherScientific公司）；BSAS-CW型天平（德国Sartorius公司）；PS-60AL型超声仪（深圳市雷德邦电子有限公司）；HZ85-2型磁力搅拌器（北京中兴伟业仪器有限公司）；DT型实验室涂布机（北京信义惠达机电设备有限公司）；宠物用电推剪（深圳科德士电器有限公司）；电子体温计[欧姆龙（大连）有限公司]。
2方法
2.1三臣小儿退热贴膏的制备
药物处方药为等比例的红花、人工牛*、天竺*，基质处方为聚丙烯酸钠、甘羟铝、酒石酸、氮酮、甘油、水、药粉（6∶0.20∶0.15∶2∶30∶48∶10）。
制备方法如下：取处方量红花，加入15倍量60%乙醇，浸泡提取3次，60min/次，合并提取液；回收乙醇，50℃减压浓缩成浸膏，备用。人工牛*和天竺*粉碎至过目筛，备用。将聚丙烯酸钠和甘羟铝加入盛有甘油的烧杯中，充分搅匀后加入处方量人工牛*、天竺*药粉和氮酮，用搅拌器混合均匀作为A相；酒石酸溶于纯化水，加入红花提取浸膏后用搅拌器搅拌均匀作为B相；将B相缓慢加入A相中，搅拌至充分交联后，涂布于无纺布上，盖上保护膜，室温下放置干燥。同法制备空白基质贴膏。
2.2分组、造模与给药
大鼠于实验环境中每日测量肛温2次，使其适应3d，实验前12h禁食不禁水，用电动剃毛器为大鼠腹部相应部位剃毛，以8%硫化钠脱毛，脱毛面积为5cm×5cm。实验当日每小时测量体温1次，连续3次，3次体温的平均值作为基础体温，剔除1次体温＞38℃及温度变化＞0.3℃的大鼠[12]。
将符合要求的大鼠按基础体温随机分为对照组、模型组、阿司匹林（mg/kg）组以及三臣小儿退热贴膏高、中、低剂量（16、8、4mg/kg，以羟基红花色素含量计）组和空白基质贴膏组，每组8只。模型组和各给药组大鼠背部sc酵母（10mL/kg）[13]，对照组背部sc等体积氯化钠注射液。造模后第4小时，阿司匹林组ig药物，三臣小儿退热贴膏组和空白基质膏组腹部脱毛部位分别贴相应贴膏，用实验用大鼠贴剂固定带加以固定。造模第7小时，各给药组再给予相应的受试药物。从造模开始，每小时测量肛温1次，连续10次。
2.3样品的采集与制备
最后1次测完体温后，大鼠ip3%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，取血后大鼠脱颈椎处死。对照组、模型组和三臣小儿退热贴膏高剂量组取血于肝素钠管中，r/min离心10min，取上清液，于?80℃保存，用于后续超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-QE-MS）分析。
取50μL样品，加入μL含同位素标记内标混合物的提取液[甲醇-乙腈（1∶1）]，涡旋混匀30s，于冰水浴超声10min，?40℃静置1h，4℃、10r/min离心15min，取上清液上机检测。所有样品另取等量上清液混合成质控样品上机检测[14]。
2.4色谱和质谱条件
2.4.1色谱条件WatersAcquityUPLCBEHAmide色谱柱（mm×2.1mm，1.7μm），流动相为含25mmol/L乙酸铵和25mmol/L氨水的水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～0.5min，95%B；0.5～7.0min，95%～65%B；7.0～8.0min，65%～40%B；8.0～9.0min，40%B；9.0～9.1min，40%～95%B；9.1～12.0min，95%B；体积流量为0.5mL/min；柱温为30℃；样品盘温度为4℃；进样体积为2μL。
2.4.2质谱条件鞘气流量体积为30arb；辅助气流量体积为25arb；毛细管温度为℃；全质谱分辨率为；MS/MS分辨率为；碰撞能量为10、30、60eV；喷雾电压为3.6kV/?3.2kV；扫描范围m/z70～。
2.5数据处理与统计学分析
2.5.1体温反应曲线的绘制计算各组大鼠体温变化，以时间为横坐标、体温变化为纵坐标，绘制体温反应曲线。
体温变化＝测得体温－基础体温
2.5.2体温反应指数的计算纵坐标按0.4℃对应1cm，横坐标按1h对应lcm的比例，计算造模后4～10h体温反应曲线与基线之间的面积，共计5个梯形的面积，数值越低，表明解热效果越好。
2.5.3代谢组学数据处理质谱仪采集的数据为“raw”格式，通过格式转换软件MSconvert将原始数据转化成“mzXML”格式，将数据进行R语言xc-ms软件包预处理[15-16]，包括峰匹配、峰对齐、滤噪、保留时间校正，最终获得1个三维数据矩阵（含保留时间、峰强度、质荷比信息），将三维矩阵信息以“csv”格式导入在线数据分析软件，导入SIMCA-P13.0进行多元统计分析，包括无监督的主成分分析（principal