共同探讨
角质层胶带剥离法—局部用药物BE评价新方法###
关键词：角质层、胶带剥离法、局部用药物、生物等效性、皮肤药代动力学
前言
局部给药局部起效药物（下简称“局部用药物”）系指应用于局部并在应用部位发挥作用的药物，如乳膏、软膏、凝胶、贴剂等。ICH及FDA等监管机构已提出皮肤局部用药物处方相似性的评价依据：①Q1等同：处方组分相同（定性等同性）；②Q2等同：处方组分相同且含量相同（定量等同性）；③Q3等同：相同处方组分和含量,且具有相同的微观结构特性-流变学性质，具有相同的体外释放特性。对于某些局部用药物品种，仅基于Q1/Q2/Q3的一致性并不能豁免体内等效性评价，这些临床评价方法包括体内药效学（PD-BE，如皮肤变白试验）、药代动力学（PK-BE）、临床终点（CE-BE）等效性等研究。对于一些经皮给药后存在一定全身性吸收的药物，如利多卡因、睾酮，可采用静脉采血法研究经皮给药后的药代动力学生物等效性（PK-BE）；而对于一些经皮给药后，全身性吸收很低或可忽略的药物，则无法通过静脉采血法评价PK-BE。本文将依据国内外局部用药物仿制药评价的等效性指导原则，并结合阳光诺和-先宁医药针对局部用药物已开展的一些探索性研究中获得的经验和成果，简述一种局部用药物的皮肤药代动力学生物等效性（DPK-BE）方法，并探讨了该研究方法的可行性。
目前文献已报告的局部用药物PK-BE方法中，除静脉采血法外，还包括角质层胶带剥离法、皮肤微透析法（DMD）和开流微量灌注法（OFM）。角质层胶带剥离法也称为皮肤药代动力学（DPK），一般选择在健康受试者的无损皮肤给药，在一定时间后采集角质层样本并定量检测药物水平，以此评价试验药物与参比药物的皮肤渗透动力学等效性。
人体皮肤主要有三层，由外及里分别是角质层（SC）、表皮层和真皮层。角质层通常是局部用药物活性成分渗透进入皮肤的主要屏障，并有研究者认为角质层内的药物水平应与皮肤底层的药物水平相关。角质层主要由15~20层无细胞核的死亡细胞组成。当这些细胞脱落时，位于基底层的细胞会被推上来，形成新的角质层。以人类的前臂为例，每平方厘米表皮在每小时会有个角质层细胞脱落，形成微尘。角质层的微观结构包括：细胞、蛋白质、脂质和角质桥粒。角质细胞大多是相对扁平无核的结构，成分包括角蛋白、酶和一些小分子物质（天然保湿因子，NMF）。角质桥粒是连接相邻细胞的微小蛋白“铆钉”，一旦桥粒受到破坏，则会引起角质细胞的松解而出现表皮内疱。脂质层由一些独特的脂质组成，其结构高度有序、各组分比例平衡：神经酰胺（50%）、胆固醇（30%）和游离脂肪酸（20%）。
指导原则
目前，支持DPK-BE研究的指导原则主要包括日本PMDA于年发布的指南《皮肤局部用药物仿制药的生物等效性试验指导原则》以及欧洲药品管理局（EMA）于年发布的指南草案《局部用药物的质量和等效性指南草案》。FDA曾于年发布了局部用药物BE/BA指南草案，其中包含了DPK研究方法，但基于之后的多方面反馈意见，该指南于年被撤销。
图3使用黏性胶带剥离角质层
日本PMDA和欧洲EMA的DPK方法基本相似，主要步骤包括：①药物施用于皮肤一段时间后，使用适当的清除手段以去除皮肤表面未被吸收的药物制剂；②使用胶带剥离相应部位皮肤角质层，其中，前2片胶带单独分析，收集之后的10~20张胶带，用适当的溶剂提取胶带中的药物并使用经验证的分析方法测定含量；③计算出用于BE评价的皮肤药动学参数。下文总结了日本PMDA和欧洲EMA指导原则中的DPK研究。
PMDA指导原则：皮肤药代动力学试验是基于稳态下存在于角质层的药物量评价生物等效性的方法。通常来说，皮肤局部药物从制剂分布到用药部位的角质层，透过角质层后到达活体表皮细胞层。黏性胶带可剥离药物使用部位的角质层，通过定量角质层中存在的药物，评价药物在皮肤的生物利用度。该方法适用于作用部位在角质层内或比角质层更深层的制剂。一次涂药会损伤角质层的药物不适合该方法。通过胶带剥离每单位面积的角质层量（层数）存在受试者内、受试者间、操作者间等变异性。因此，即使规定了剥离操作的次数，相对于角质层总体厚度，所剥离的角质层厚度，也就是角质层的回收率会因受试者而异，这就是通过皮肤药代动力学试验评价生物等效性时使检验效能降低的最大原因。利用回收的角质层质量进行校正，用平均角质层内药物浓度评价药物回收量，或者采用附录1所示的方法，将回收到的角质层按角质层厚度L标准化后计算角质层总体的药物浓度，同样可以提高检验效能。通过对预试验、主试验数据进行统计处理，等效性评估参数包括稳态下的药物回收量、平均角质层内药物浓度及角质层内药物浓度。原则上将数据进行对数转换，采用参数法计算参比药物和试验药物间等效性评价参数平均值差的90%置信区间。
EMA指导原则：该指导原则适用于局部给药和局部作用的皮肤外用药物，也适用于某些其他药物，如耳用或眼用制剂。对于外用药物，处方、剂型、给药方法或生产工艺的变更可能会显著影响有效性和/或安全性。原则上必须开展临床治疗等效性研究，但可以使用或开发其他模型，包括体外和体内模型替代临床数据，以确定治疗等效性。仅证明质量等效性通常不足以预测治疗等效性。在适当情况下，可使用与参比药物的比较数据确立质量等效性，包括剂型、定性和定量组成、微观结构/物理性质、产品性能、给药。疗效等效性需要比较渗透动力学，并在可能的情况下，需要与对照药物进行药效学研究。适用的渗透动力学方法为人类皮肤体外渗透、人体志愿者角质层（S.C.）体内采样（胶带剥离）和药代动力学生物等效性。如果渗透动力学和药效学研究不适用或认为不能充分预测临床反应，通常需要临床有效性数据。
表1EMA和PMDA指导原则差异
先宁医药根据EMA和PMDA的指导原则，深入研究了多款外用制剂，如使用某治疗痤疮的外用凝胶开展了多次DPK-BE探索性试验。获得的一些经验总结如下：
1）DPK试验与皮肤状态、环境温度、湿度都密切相关，试验必须严格控制环境温湿度；
2）通过采购相同品牌的压力棒和黏性胶带，并且设计不同用途的辅助限位贴以尽量减少给药和取样操作偏差；
3）由于生物样本为角质层，样本的保存、运输、提取和检测方法都有全新的操作细节与规程。
讨论
目前，日本仿制药生产商已广泛采用DPK-BE方法评价局部用药物的生物等效性，如洛索洛芬钠、阿达帕林，并且日本PMDA早在年已发布了相关的指导原则。对于某些皮肤给药后全身性吸收不显著的非皮质激素类局部用药物，虽可通过CE-BE方法评价仿制药的生物等效性以获得监管机构批准，但相对来说，CE-BE方法需要耗费更大的人力、财力、物力和时间，这将给申办方带来非常大的负担，并因此降低企业开发此类药物的积极性。如果DPK-BE能被认可，无疑将为局部用药物仿制药的发展带来便利条件。此外，DPK-BE属于无创采样，相比静脉穿刺采样，对受试者的影响更小。
DPK方法最早由FDA发布，之后又被撤销，撤销原因主要包括：①不同类型皮肤疾病牵涉到的需治疗的皮肤组织不一，需要药物活性分子到达的皮肤深度不一，有的疾病需要药物到达表皮及真皮层发挥作用；②方法的可重复性，FDA指定剥离相同层数胶带，然而，由于不同个体（不同皮肤部位）角质层厚度差异很大，且剥离效果受环境因素影响（如胶带黏附时间、压力大小、剥离速度、温度、湿度等），这种情况下黏取的角质层总量往往并不相同，导致不同受试者（不同治疗部位）间参数的对比并无意义，不同实验室结果可能有很大差异。但是，从另一方面来说，FDA支持某些局部用药物的静脉采血PK-BE，而静脉血样的药物浓度与皮肤疾病所需的治疗浓度并无直接关系。而对于第2点原因，经过先宁医药反复地探索和学习，发现胶带剥离法确实受环境影响较大，在适当地控制环境条件后，我们克服了这些不利因素，也证明了DPK方法的可重复性，需预先制定合理可行的试验方案和SOP并严格执行。我们有信心并有理由相信，在开展大样本量研究之后，将更深刻地认识DPK方法，并为局部用药物仿制药的开发提供经验和支持性信息。
目前，国家药品监督管理局（NMPA）尚未发布支持DPK-BE研究的指导原则，且国内尚无通过DPK-BE批准局部用药物仿制药的先例。但是，NMPA最近发布的指南《局部给药局部起效药物临床试验技术指导原则》也鼓励申请人积极探索先进的无创采样和/或检测技术和方法开展局部药代动力学研究。由此，DPK-BE是一种很有前景的BE研究方法，是否能被NMPA接受，需要医药从业者付诸更多的努力，提供可靠的理论依据以证明该方法的可行性。
先宁医药是一家致力于外用制剂临床研究的CRO公司，我们积累了一些局部用药物品种的临床评价经验，品种包括阿达帕林凝胶、夫西地酸乳膏、克立硼罗软膏、过氧苯甲酰凝胶、甲硝唑凝胶、洛索洛芬钠凝胶贴膏、氟比洛芬凝胶贴膏、利多卡因凝胶贴膏、莫匹罗星等。热忱欢迎业界同行与我们互动交流，共同推进我国局部用药物临床评价的方法建立和标准制定。